細(xì)胞爬片免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟

　　天：

　　1.在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；

　　2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；

　　3.0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min（細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟）；

　　4.PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；

　　5.吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜；

　　第二天：

　　6.加熒光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；

　　注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。

　　7.復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；

　　8.用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

　　細(xì)胞爬片抗原修復(fù)液是一種特別適合用于細(xì)胞爬片的快速抗原修復(fù)液，只需室溫孵育5分鐘即可完成對(duì)細(xì)胞爬片樣品使用多聚甲醛、甲醛或其它醛類試劑固定后的抗原修復(fù)。

　　使用說(shuō)明：1，細(xì)胞爬片固定后用PBS洗滌3次，每次5min。2，加入抗原修復(fù)液使其覆蓋住細(xì)胞爬片，室溫孵育5min。3，PBS洗滌細(xì)胞爬片，重復(fù)3次，每次5min。充分洗滌殘留的SDS，以免造成抗體失去活性。4，封閉液封閉細(xì)胞爬片。5，隨后即可進(jìn)行一抗孵育等后續(xù)的免疫染色步驟。